La chiesa che si affaccia su piazza dei Cavalieri, fu edificata nel '500, sulle fondamente di una precedente chiesa intitolata a San Sebastiano, e demolita per volere di Cosimo I. Il tempio ha una fronte ben diversa da quella che era stata prevista dal progetto del Vasari, sulla facciata in marmo bianco spicca lo stemma della famiglia Medici e con quello relativo all'ordine dei cavalieri.

In precedenza l'interno era composto da un'unica navata, solo nel '600 furono aggiunte le due laterali. Il soffitto ligneo è decorato ad intagli dorati, realizzato nel XVII sec. L'ordine di Santo Stefano dei Cavalieri fu voluto da Cosimo I Medici per contrastare l'ondata dei Turchi, in questo tempio sono racchiusi vari cimeli e trofei, come una serie di bandiere di navi recentemente restaurate ed esposte. Fra tutti gli elementi all'interno della chiesa si ricordano le due acquasantiere e la rappresentazione della lapidazione di Santo Stefano, opere del Vasari.